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液相色谱法解析葡萄酒中的有机酸
酒品营销网 / 2012-03-26

　1 酸在葡萄酒中的作用

　　葡萄酒中只有少量的无机酸，如硫酸和磷酸，大部分酸是有机酸。葡萄酒中的酸主要以游离态或以盐类的形式存在（见表1），葡萄酒中的酸主要有：酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、碳酸、醋酸。酸在葡萄酒的酿造中和酿造后都占有着重要的地位，它存在于葡萄和葡萄酒中，直接作用于葡萄酒的颜色、葡萄酒的平衡感和葡萄酒的口感，酵母在发酵过程中的活性和保护葡萄酒免受细菌的侵害。

　　常用“总酸”来衡量葡萄酒中酸的含量，一般用pH值来标志，葡萄酒的酸度值介于2.9—3.9之间，pH值越低则酸度越高，反之，pH值越高则酸越高。酿酒葡萄中最主要的三种有机酸是酒石酸、苹果酸、柠檬酸。

　　在葡萄酒的酿造过程中和酿造后，葡萄酒中的醋酸、酪酸、乳酸和琥珀酸起着很重要的作用。葡萄酒中的酸（除了醋酸不稳定，易挥发，会让葡萄酒变质）还算都是比较稳定的酸类。

　　可根据检测葡萄酒中有机酸的变化来确定和观察葡萄酒的发酵过程。

　　2 检测原理

　　酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸均属水溶性有机酸，所以酒样可经过稀释、过滤后直接进样，用高效液相色谱仪C18柱将各种有机酸分离，经紫外检测器检测，并用标准物的保留时间进行定性，外标法定量测定。

　　3 试剂
3.1 磷酸溶液（0.01mol/L）。
3.2 磷酸氢二钾溶液（0.01mol/L）。
3.3 有机酸标准品（色谱纯）：酒石酸、D—苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸。
3.4 超纯水。
3.5 标准溶液的配制：

　　标准储备液：分别称取6种有机酸100mg用超纯水，定容至10ml使其浓度为10mg/ml。
标准混合液：分别吸取10 mg/ml单标100ul，加超纯水定容至1ml，使其浓度为1mg/ml。
工作曲线的配制：用微量移液器分别称取标准混合液0.0ul、100ul、200ul、300ul、400ul、500ul、600ul 并定容至1ml，各稀释液经0.45μm的过滤膜过滤后直接进样。

　　4 检测用仪器、设备
　　4.1 高效液相色谱仪带紫外检测器VARIAN PROSTAR。
4.2 酸度计 PHS—3CT。
4.3 溶剂过滤器。
4.4 可调式移液器。

　　5 色谱条件
5.1 色谱柱：汉邦lunaS C18柱，250mm*4.6mm*5um。
5.2 流动相：将0.01mol/L磷酸溶液（将0.714 ml 85%H3PO4溶至1000 ml）和0.01mol/L磷酸氢二钾溶液（将2.2822g K2HPO4·3H2O溶解后定容至1000ml），混合调至pH=2.70的缓冲溶液，临用前过滤，脱气后使用或亦可用在线脱气法。
5.3 柱温：25.0℃。
5.4 流速：0.8ml/min。
5.5 紫外检测波长：215nm。
5.6 进样量：20μl。

　　6 酒样的处理
将需要检测的葡萄酒样经5倍（可根据有机酸含量的高低确定稀释的倍数）稀释后，用0.45μm的过滤膜过滤后进样测定。

　　7 分析步骤
7.1 标准曲线的制备将配制好的有机酸的工作曲线溶液由稀到浓分别进样测定，得其色谱图。
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做酒石酸、苹果酸的标准曲线，并计算出回归方程（见图1）。
7.2 酒样分析：将处理酒样（即将待检葡萄酒样稀释10倍后，用0.45um的滤膜过滤）进样得色谱图。
定性：对照标准色谱图中各有机酸的保留时间定性。
定量：求出酒样中各个有机酸的峰面积，根据回归方程计算求出其含量。

　　8 结果计算
可根据要求算出样品重量含量或体积含量，以葡萄酒小样1#、2#为例（见表2）。

　9 注意事项

　　9.1 流动相的pH微小变化对测定影响不大，但pH应不低于2.5。

　　9.2 应现处理酒样，现进样，否则有机酸易于挥发，影响测定的结果。

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